一、儀器簡介
高效液相色譜儀（HPLC）是實驗室常用精密分析設備，主要由高壓輸液泵、進樣系統、色譜柱、檢測器、柱溫箱及數據工作站組成。適用于食品、化工、環保、質檢等行業，用于樣品成分分離、定性檢測、定量分析及純度檢測，具有分離效果好、精度高、重復性穩定的特點。
二、實驗前準備
1. 流動相準備
所有流動相必須使用色譜純試劑，純水建議使用超純水。配制完成后，需經過濾膜過濾處理，水系溶液用水系濾膜，有機溶液用有機濾膜，去除雜質防止堵泵、堵柱。過濾完成后進行超聲脫氣15至20分鐘，排出液體內部氣泡，避免運行中壓力波動、基線漂移、雜峰干擾。含鹽、緩沖鹽流動相需現配現用，不可隔夜使用，防止滋生細菌、結晶堵塞管路。
2. 樣品準備
樣品需用匹配溶劑或流動相充分溶解，確保無沉淀、無懸浮顆粒。樣品溶液必須經過0.22微米濾膜過濾，去除微小雜質，避免污染色譜柱和進樣閥。樣品濃度不宜過高，濃度過大容易造成柱過載、峰形變差、拖尾嚴重；濃度過低會導致響應值低、檢測誤差偏大。
3. 設備檢查與色譜柱安裝
開機前檢查電源線、信號線、管路接口是否完好，廢液瓶是否清空，溶劑瓶干凈無雜質。安裝色譜柱時嚴格按照柱體箭頭流向安裝，不可反裝，接頭適度擰緊，避免漏液或壓力異常。新色譜柱或長期未使用的色譜柱，需先用純甲醇低流速沖洗活化，穩定柱體狀態。
三、開機操作流程
嚴格按照順序開機，禁止亂序操作。首先打開高壓輸液泵電源，設置壓力上限保護，防止超壓損壞設備；其次打開柱溫箱電源，設定所需恒溫溫度；再打開檢測器電源，提前預熱30分鐘保證光源穩定；最后打開電腦及工作站軟件，連接儀器，等待設備自檢完成。
開機后先打開排液閥，開啟 purge 排氣功能，排出管路內部空氣，直至流出液體無氣泡，關閉排液閥。使用純有機相沖洗管路和色譜柱，待系統穩定后切換至實驗所需流動相，平衡系統基線，直至壓力穩定、基線平直后方可進樣檢測。
四、參數設置與樣品檢測
根據實驗方法設置參數，常規色譜柱流速設置為1.0毫升每分鐘左右，柱溫控制在25至40攝氏度，根據檢測物質設定對應紫外波長。進樣體積根據標準方法設定，常見為5至20微升。
手動進樣時，將進樣閥調至加載位置，用微量注射器吸取無氣泡樣品，平穩注入進樣口，快速切換至進樣位置，同時點擊工作站開始采集數據。自動進樣模式只需在軟件中設置樣品序列、進樣量、循環次數，設備即可自動完成進樣、分離、檢測、保存數據。
檢測過程中觀察壓力變化、基線狀態和出峰情況，正常圖譜峰型對稱、無雜峰、無嚴重拖尾，壓力保持平穩。通過保留時間進行定性分析，通過峰面積完成定量計算。
五、實驗結束清洗與關機步驟
實驗結束不可直接關機，必須先清洗系統保護色譜柱。若使用過緩沖鹽、含鹽流動相，需先用純水或低比例甲醇水沖洗管路及色譜柱，沖凈鹽分，防止結晶堵塞。隨后更換高比例有機相繼續沖洗，最后用純甲醇或乙腈保存色譜柱，保證柱內充滿有機溶液，防止干柱、發霉、填料損壞。
關機順序遵循先關檢測器、再停泵、最后關閉柱溫箱及電腦軟件的原則。全部斷電后整理管路、清理廢液、登記設備使用記錄，色譜柱兩端裝好密封帽妥善存放。
六、重要注意事項
設備運行期間禁止隨意打開機箱、觸碰高壓管路，防止漏液、高壓沖擊。禁止突然啟停流速，避免壓力驟變導致柱床塌陷。流動相需匹配色譜柱耐受酸堿度，強酸強堿環境會損壞色譜柱填料。嚴禁使用未過濾、未脫氣的流動相和樣品上機。日常使用保持儀器干燥、潔凈，定期更換泵密封墊、單向閥，定期校準檢測器，保證檢測精度。長期不用設備需每周開機沖洗保養一次，延長儀器與色譜柱使用壽命。
